Международный научный совет Медицинского института РУДН. Лекция «Генно-инженерные подходы к получению рекомбинантных белков и пептидов для биотехнологии, фармацевтики и исследований»

В рамках проведения Международного научного совета по медицинским наукам РУДН 21 ноября 2018 года выступил с лекцией: «Генно-инженерные подходы к получению рекомбинатных белков и пептидов для биотехнологии, фармацевтики и исследований» доктор биологических наук А.Н. Федоров.

В лекции рассмотрены подходы, применяемые к эффективному получению рекомбинантных белков и пептидов для биотехнологии, фармацевтики и исследований на примере конкретной работы, которая выполняется при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ.

Целью лекции стало объяснение того, как те или иные подходы генной и белковой инженерии применяются и адаптируются, а также разрабатываются новые, в зависимости от поставленной задачи и предъявляемых требований к продукту.

Проблема эффективного получения гидрофобного белка в стабильной растворимой форме для применения в терапии рассмотрена на примере работ с рецептор-связывающим доменом альфа-фетапротеина человека. Рецептор-связывающий домен альфа-фетапротеина человека может быть использован в терапии опухолей для направленной доставки лекарств-цитостатиков. Белок гидрофобный, формирует многочисленные S-S связи и при экспрессии в бактериальных клетках образует нерастворимые агрегаты, т.е. тельца включения. Была разработана масштабируемая технология эффективного получения данного белка в растворимой форме с параметрами, отвечающими требованиям к терапевтическим белкам. В частности, для выполнения этой задачи был разработан подход к эффективной ренатурации крупного белка с S-S связями путем ренатурации на твердой фазе.

Проблема биосинтетического получения небольших полипептидов рассмотрена на примере двух форм натрийуретического пептида мозга, используемых в диагностических системах ранней диагностики инфаркта миокарда и других заболеваний сердца. Задачей стало получение рекомбинантных пептидов, идентичных природным, без включения каких-либо последовательностей, облегчающих их выделение. Для отработки эффективной системы получения пептидов были использованы как системы прямого биосинтеза пептидов, так и в составе слитых белков. Была создана эффективная технология получения пептидов, основанная на получении слитого белка, состоящего из пептида с тиоредоксином как белком-носителем, отделение целевого пептида обработкой высокоспецифичной протеазой по заранее введенному сайту, и затем очисткой пептида.

Молекулярные шапероны – это белки, предназначенные для помощи в сворачивании вновь синтезированных белков и поддержании белков в растворимом состоянии. Многие свойства шаперонов делают их привлекательными объектами для использования в биотехнологии и фармацевтике, вместе с тем, чтобы сделать их действительно удобным инструментарием для решения существующих задач, требуется получение их специально созданных форм с применением методов белковой инженерии. Шапероны семейства GroEL представляют собой крупные частицы, состоящие из двух гептамеров, т.е. колец, каждое из которых состоит из 7 мономеров, каждый размером 60 кДа. Частица образует полость, внутри которой связываются многие белки, что способствует их сворачиванию в активные  природные структуры. Мы использовали эту частицу как исходную форму для создания частицы с целью биосинтетического получения пептидов. В этой системе пептид находится внутри частицы, что дает возможность получения даже токсичных пептидов, в том числе и наиболее токсичных для бактериальных клеток. Разработанный метод является  простым, легко масштабируемым и привлекательным для получения широкого круга пептидов.

Частая задача как в биотехнологии, так и исследованиях – получение гидрофобных полипептидов и белков в растворимых формах. Будет описана разработанная нами система на основе минишаперона, позволяющая стабилизировать гидрофобные белки, в том числе даже полностью нерастворимые белки, в стабильных растворимых формах. Для этого создаются слитые конструкты из целевого белка и термостабильного минишаперона, которые, хотя могут продуцироваться в бактериальных клетках в виде телец включения, после ренатурации оказываются растворимыми, стабильными и выдерживают все стандартные биохимические манипуляции.